过滤法质粒中量提取试剂盒II(Plasmid ezFilter midi kit II)可在50~100mL**培养液中纯化400μg高纯度质粒DNA。 过滤法质粒中量提取试剂盒II组分: Catalog # PD1414-01 Preps 10 ezBindTM Columns 10 Filter syringe(25 mL) 10 Buffer A1 55 mL Buffer B1 55 mL Buffer C1 70 mL Buffer KB 50 mL RNase A (20 mg/mL) 5.5 mg(275 µL) Elution Buffer 20 mL User Manual 1 保存条件: RNAse A在4℃下可以保存一年,Buffer A1加入RNase A 后4℃保存,其它组分室温保存。 注意事项: 1、质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时,使用2倍的菌液体积,2倍的Buffer A1,B1,C1,100%乙醇,相同体积的Wash Buffer (70% 乙醇)和Elution Buffer. 2、转化菌:若为-70oC甘油冻存的菌,请先涂布平板培养后,再重新挑选新的单个菌落进行培养。切勿直接取冻存在4℃的菌进行培养。 3、柱结合能力:450μg 过滤法质粒中量提取试剂盒II操作简明步骤: 1、取100 µL新鲜的菌液接种到15-80 mL (勿超过 100 mL)的LB培养基(含适量***),37oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟,收集菌体,并尽可能的吸去上清。 2、加入5 mL Buffer A1(确保已加入RNase A),用移液器或涡流震荡确保**沉淀重新悬浮。 3、加入5 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀,然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。 4、加入6 mL Buffer C1, 立即反转5次,用手用力摇晃3-5次充分混匀,此时出现白色絮状沉淀。 5、将裂解液转移至过滤器中,放在一个50 mL的试管上静置10分钟。管中的白色絮状沉淀浮上来,对准50 mL的管向下压,使裂解液尽可能多的通过,有些裂解液可能会残留在沉淀中。注:静置10 分钟时RNase A将工作,排除RNA污染。 6、加入6 mL 100% 乙醇,立即混匀,需马上离心过DNA柱。 7、立即转移6.0 mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中,室温下> 2,500 x g 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复此步直至所有的溶液通过DNA柱。 8、可选: 向DNA柱中加入4.0 mL Buffer KB, 室温下> 2,500 x g 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。 9、向离心柱中加入5.0 mL 70% 乙醇,室温下>2,500 x g 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“9”。 10、将离心柱放回高速离心机中,室温下>2,500 x g 开盖离心10分钟,以彻底去除残留的乙醇。 11、将离心柱转至一个新的15 mL离心管中,向DNA柱膜的正中加入0.5-1 mL**ddH2O(pH在7.0-8.5之间)或Elution Buffer,室温放置1分钟,>2,500 x g离心5分钟,以洗脱质粒DNA。若想提高得率,将15 mL离心管中的洗脱液再加到柱的中间,>2,500 x g离心5分钟以洗脱质粒DNA。 过滤法质粒中量提取试剂盒II操作流程:
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