无内**质粒中量提取试剂盒

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产品名称: 无内**质粒中量提取试剂盒

产品型号: PD1416-02

产品品牌: Biomiga

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简单介绍

无内质粒中量提取试剂盒（EndoFree plasmid ezFilter midi kit）从15～50 mL菌液中纯化200 μg无内质粒DNA。

无内**质粒中量提取试剂盒 的详细介绍

无内**质粒中量提取试剂盒（EndoFree plasmid ezFilter midi kit）从15～50 mL菌液中纯化200 μg无内**质粒DNA。

无内**质粒中量提取试剂盒组分：

Catalog #	PD1416-02
Preps	25
EzBind^TM Columns	25
Filter syringe (25 mL)	25
Buffer A1	70 mL
Buffer B1	70 mL
Buffer N3	100 mL
Buffer KB	85 mL
EndoClean Buffer	25 mL
RNase A (20 mg/mL)	7 mg(350 μL)
Endofree Elution Buffer	50 mL
User Manual	1

保存条件：

RNAse A在4℃下可以保存一年，Buffer A1加入RNase A 后4℃保存，其它组分室温保存。

注意事项：
1、质粒拷贝数：纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,N3,100%乙醇，相同体积的70% 乙醇和Endofree Elution Buffer..
2、转化菌: 若为-70^oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。切勿直接取冻存在4^oC的菌进行培养。
3、柱结合能力：250μg。
4、对富含内源核酸酶的宿主菌（endA＋）如HB101, JM101, TG1等，需去核酸酶，请使用产品PD1712。

无内**质粒中量提取试剂盒操作简明步骤：
1、取50 µL新鲜的菌液接种到15-50 mL (勿超过 50 mL)的LB培养基（含适量***），37^oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
2、加入2.5 mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保**沉淀重新悬浮。
3、加入 2.5 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。
4、加入600 µL Buffer N3, 立即反转5次，用手用力摇晃3-5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。
5、将裂解液转移至过滤器中，放在一个15 mL的试管上静置10分钟。管中的白色絮状沉淀浮上来，对准15 mL的管向下压，使裂解液尽可能多的通过，有些裂解液可能会残留在沉淀中。注：静置10 分钟时RNase A将工作，排除RNA污染。
6、定量吸取离心后的上清液至新的15 mL管中（避免吸起沉淀），加入0.1 倍体积的EndoClean Buffer，混匀后冰浴10分钟，其间不时摇匀(若EndoClean Buffer粘稠难吸，可将枪头剪掉头后再吸取)。
7、室温下(冰浴取出后务必使溶液温度恢复到23^oC以上，否则溶液不分层)13,000 x g离心10分钟（也可在2,500 x g离心15 min)。此时溶液分为两层，上层水相含有质粒，下层红色有机相含有内**。
8、将上层水相转移至一个新的15 mL管中，加入3 mL 的Buffer N3及3 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混匀，该混合溶液需要需马上进行过柱吸附操作。
9、立即转移6.0 mL裂解液至带收集管的DNA柱中，室温下> 2,500 x g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复此步直至所有的溶液通过DNA柱。
10、可选: 向DNA柱中加入 3.0 mL Buffer KB, 室温下> 2,500 x g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。
11、向离心柱中加入5 mL 70% 乙醇，室温下> 2,500 x g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“11”。
12、将离心柱放回高速离心机中，室温下> 2,500 x g开盖离心10分钟，以彻底去除残留的乙醇。
13、将离心柱转至一个新的15 mL离心管中，向DNA柱膜的正中加入0.5 mL的Endofree Elution Buffer，室温放置1分钟，> 2,500 x g 离心5分钟，以洗脱质粒DNA。若想提高得率，可用洗脱得到的0.5 mL的Endofree Elution Buffer。再洗脱一次，收集到新的离心管中。

无内**质粒中量提取试剂盒操作流程：

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无内**质粒中量提取试剂盒（EndoFree plasmid ezFilter midi kit） 从15～50 mL菌液中纯化200 μg无内**质粒DNA。

无内质粒中量提取试剂盒（EndoFree plasmid ezFilter midi kit）从15～50 mL菌液中纯化200 μg无内质粒DNA。