包装量：
产品组成、储存、浓度：
储存：-20 ℃ 避光保存6个月，使用前充分溶解混匀。短期使用可放在4 ℃，避免反复冻融。
制品说明：
本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将热启动HotMaster Taq DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA和SYBR Green I等试剂预混成一种适合Real Time PCR反应检测用2×Premix Type试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板、引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。
本品采用全新的Hotmaster Taq DNA 聚合酶，该酶不同于一般Hot-start 酶之处在于，一般的Hot-start 酶只在**步温度升高之前封闭酶的活性，而Hotmaster Taq DNA 聚合酶是利用抑制剂通过温度调节方式封闭Hotmaster Taq DNA聚合酶的底物结合位点，温度低于40℃时，形成非活性的酶-抑制剂复合物，当温度升高至引物特异性的退火温度时，结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动，因此*大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量PCR反应的**性。
注意事项：
1. 本制品不含参比染料ROX，客户可根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
2. 本制品含SYBR Green I 强光下易分解，降低灵敏度，使用时避免长时间强光照射本制品。
3. 建议在冰上配制PCR反应液，再放入PCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。
4. 本制品含有4 mM MgCl2(反应体系终浓度是2 mM Mg2+)，可用25mM MgCl2 优化Mg2+浓度。
建议PCR条件(以50 μL 反应体系为例，反应液配制请在冰上进行)
PCR 循环(三步法)
荧光定量PCR实验常见问题和解决方案
A1: 无信号值出现
Q1：
1. 反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环(如至45cycles)，但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2. 检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3. 引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。
4. 引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5. 模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的*高浓度做起。
6. 模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
A2: CT值出现过晚
Q2：
1. 扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。
2. PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3. PCR产物太长。一般采用80-150bp的产物长度。
A3: 标准曲线的线性关系不佳
Q3：
1. 加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2. 标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3. 引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。
4. 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
典型扩增曲线和融链曲线图
沪公网安备 31011502007621号
