Cy Dye mono-reactive NHS Esters(菁染料琥珀酰亚胺酯)

    

2. 菁染料琥珀酰亚胺酯(CyDye NHS)的标记

        菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之间荧光强度*高， F/P值过高荧光探针会自我淬灭并影响生物分子的生物活性，标记生物分子*好是用单琥珀酰亚胺酯，但是用双修饰的Cy Dye NHS并没有发现交联。
        Cy Dye NHS标记抗体在pH (8.5～9.4)时10分钟F/P可达5～6，而在pH 7.0几乎不反应。我们用不同比例的Cy3标记anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗体发现用1:1, 5:1, 10:1 和 20:1标记时得到的F/P值分别是 0.28:1, 1.16:1, 2.3:1 和4.6:1。

3. 操作步骤
3.1 水溶性Cy3 NHS标记anti-GST多克隆抗体
市场上买到的抗体如果含有其它蛋白(例如serum albumin或gelatin等)或带氨基的缓冲液会影响标记，在标记前需纯化。
1. 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗体(浓度为 0.5 mL at 3 mg/mL)，常温透析4小时。
2. 在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析过夜。
3. **天用1 L 0.1 M NaHCO3 (pH 8.3)透析4小时。
4. 用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。
5. 用0.1 M NaHCO3 稀释少量的抗体，在280nm处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量 (IgG antibody摩尔吸光系数170 000 M^-1 cm^-1 at 280 nm).
6. 用DMSO配置Cy3 NHS (MW 765.95) 溶液浓度为10 mg/ml; 计算所需体积以得到想要的Cy Dye NHS 和抗体的比值(例如20:1)，然后慢慢将其加入到抗体溶液中，同时在暗处常温缓慢搅拌45分钟。
7. 用1 L 0.15 M NaCl 溶液常温避光透析4小时除去未标记上的Cy3。
8. 在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析过夜。
9. 用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% 叠氮化钠溶液常温避光透析4小时, 在4°C常温避光再次透析过夜。
10. 用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。
11. 用0.01 M PBS/0.01 % 叠氮化钠整数倍稀释标记抗体溶液，测量280nm(蛋白)和552nm(Cy)处的紫外可见吸光度。
12. 产品冷冻干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01% 叠氮化钠溶液中，-20℃避光储存。
F/P计算：
Cy3在552nm摩尔吸光系数为150 000 M^-1 cm^-1;此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170 000 M^-1 cm^-1;
不同蛋白的摩尔吸光系数不一样;.Cy3 染料本身在280 nm 的吸收是552nm处的8%。按以下公式计算F/P值。
[Cy3] = A₅₅₂/150000
[antibody] = {A₂₈₀ - (0.08×A₅₅₂)}/170000
F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A₅₅₂}/ {A₂₈₀ - (0.08×A₅₅₂)}
3.2 水溶性Cy5 NHS标记 (D-ser²)-leucineenkephalin
1. Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于400 ul DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser²)-leucine-enkephalinacetate (YSGFLT, 0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。(Dye 和peptide 投料比是 1:1)
2. 然后加入15 μL三乙胺，常温避光搅拌反应混合物过夜。
3. 用HPLC 纯化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上样注入2×400 ul，30分钟梯度洗脱从0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O(0.1% TFA)=70∶30，流速4mL /min。(对不同的蛋白选择不同的合适HPLC梯度流动相)
4. 收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。
5. 产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光储存;必要时可用质谱表征。
6.CyDye标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4 ℃可避光保存2月;更长期的保存需加入等体积的甘油-20 ℃避光保存。
F/P计算：
Cy5 在650 nm 的摩尔吸光系数为250 000 M^-1 cm^-1 ，所用蛋白在280 nm处的摩尔吸光系数为 170000 M^-1 cm^-1;Cy5在280nm处的吸收是650nm处的5%。按以下公式计算F/P值。
[Cy5 dye] = (A₆₅₀)/250 000
[peptide] =[A₂₈₀ -(0.05×A₆₅₀)]/170 000
F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A₆₅₀}/ {A₂₈₀ - (0.05×A₆₅₀)}
3.3水溶性 Cy Dye SE标记OLIGO
        氨基封端的OLIGO可以标记Cy Dye SE，但是非常困难;标记前因为OILGO经氨水脱保护，请务必洗涤掉所有的残余氨水。然后将样品真空干燥;然后溶于0.25 ml 的0.5 M NaCl 溶液中，用Sephadex G-50脱盐，用5.0 mM borate 缓冲液平衡到pH=8.0，然后用以上硼酸缓冲液冲下OLIGO。然后浓缩至干的样品溶于0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0);在0.5mL碳酸缓冲液中30 nmoles的OLIGO加入到Cy Dye SE的玻璃瓶中室温避光，密闭搅拌反应60min。反应物经Sephadex G-50或 RP-HPLC过柱纯化，冷冻干燥后避光保存。
注意：Oligonucleotides 和oligopeptides由于太小经常会留在过滤膜上或在冻存管内贴壁成膜，而无法标记。
3.4活体成像领域
        SPF级 BALB/C裸鼠，6～8 周龄, 18～20克, 实验前24 h 自由进食、饮水。
        于实验裸鼠腹腔内注射2%****钠300μL(215 mg/ kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活体成像系统的记录暗箱中。实验时将Cy7 或Cy7 标记的生物分子或**DMSO 稀释后,于裸鼠尾静脉注射200μL( 0.5 mg/g) [*佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和**试剂等条件优化] ,每5min 记录1张动物在体内发射荧光的成像图片,分析荧光**的分布情况。对照鼠不注射**，进行同时记录。记录结束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器，进行成像。
Cy7 检测时激发波长700～770 nm 带通 ,发射波长790 nm 长通。液晶可调谐滤光片扫描范围 780～950 nm ,扫描步进10 nm。曝光时间为500 ms。
不同的**代谢时间不一样，注射入裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈现显著的肾排泄的特点一般4~6 小时，快得只有30 分钟;如果是骨骼等部位靶点的Cy7 标记**，有客户反映一周后活体成像系统仍能检测到荧光成像。
        器官切片观察：将解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醛固定4 小时以上，0%，20%，30%PBS 蔗糖依次沉底，20μm 切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片，晾干，DAPI 染色。共聚焦显微镜观察，激光器为氦氖 633 nm。

稳定性与储存：
        未开封的粉末在避光干燥-20℃存放12月。CyDye NHS水溶液现配现用不能储存。任何溶解后的Cy Dye NHS粉末*好立即使用；无水的DMSO溶液-20°C保存*多2个星期。

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